微生物量：微生物大小及数量的测定
微生物大小及数量的测定
一、实验目的
1.学习并掌握用测微尺测定微生物细胞大小的方法。2.了解血细胞计数板的构造及计数原理。
3.掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。
二、实验原理
1.微生物大小测定原理
微生物细胞的大小是微生物的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。其测量工具有目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺是中央部分刻标准刻尺的载玻片，其尺度总长为1mm，精确分为10个大格，每个大格又分为10个小格，共100小格，每一小格长度为0.01mm，即10μm。如图1。
图1镜台测微尺中央部分及镜台测微尺校正目镜测微尺
目镜测微尺，如图2，是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，一般有等分为50小格和100小格两种。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微放大后的细胞物象。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格在不同条件下所代表的实际长度也不一样。
图2目镜测微尺
2.血球计数板测定微生物数量的原理血细胞计数板是一块特制的载玻片，其上由4条槽构成3个平台。中间较宽的平台又被一段横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分9个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25
个中方格，
而每个中方格又分成16小方格（图5-2）；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是2400个。每一个大方格边长为1mm，则每一个大方格的面积为1mm，盖上盖玻片后，盖玻片
3与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm（10-4mL）。以25个中方格的计数板为例，设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，则：
1mL菌液中的总菌数=A/5×25×10×B图3血球计数板侧面及两种类型的计数室
三、实验
1.菌种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)斜面培养物；酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)液体培养基培养物。
2.溶剂和试剂
合成培养基（酵母菌液），稀释的美蓝染液（0.01%），95%酒精，二甲苯溶液，香柏油，无菌水
3.仪器和其他用品
血球计数板，显微镜，载玻片，酒精灯，接种环，盖玻片，擦镜纸，镜台测微尺，目镜测微尺，无菌毛细滴管，双层瓶，计数器
四、实验步骤
1、微生物大小的测定（1）装目镜测微尺
取出接目镜，把目镜上的透镜片旋下，将目镜测微尺刻度朝下放在目镜镜筒内的隔板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。（2）校正目镜测微尺
①放镜台测微尺
将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上。②校正
先用低倍镜观察，将镜面测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰的看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。利用移动器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台微尺和目镜微尺所占的格数
③计算
由于已知镜台测微尺每格长10μm，根据下列公式即可分别计算处在不同放大倍数下，目镜测微尺每个所代表的长度。
目镜测微尺每个长度（μm）=
用同样的方法换成高背景和油镜进行校正，分别测出在高倍镜和油镜下，两重合线之间两尺分别所占的格数。(注意：观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台微尺的刻度；换高倍镜和油镜校正时，务必十分细心，防止接物镜压坏镜台微尺和损坏镜头。)（3）对枯草芽孢杆菌用简单染色法制片（4）菌体大小的测定
①枯草芽孢杆菌大小的测定
目镜测微尺校正完毕后，取下镜台测微尺，换上细菌染色制片。先用低倍镜和高倍镜找到标本后，换油镜测枯草芽孢杆菌的宽度和长度。测定时，通过转动目镜微尺和移动载玻片，测出细菌直径或宽和长所占目镜测微尺的格数。最后将所测得的格数乘以目镜测微尺（用油镜时）每格所代表的长度，即为该菌的实际大小
②酵母菌大小的测定测定酵母菌时，先将酵母菌培养物制成水浸片，然后用高倍镜或油镜测出宽和长各占目镜微尺的格数，最后，将测得的格数乘上目镜微尺（用高倍镜或油镜时）每格所代表的.长度，即为酵母菌的实际大小（注意：可选择有代表性的3~5个细胞进行测定；细菌的大小需用油镜测定，以减少误差）
（5）测定完毕，取出目镜测微尺后将接目镜放回镜筒，再将目镜测微尺和镜台测微尺分别用擦镜纸擦拭干净，放回盒内保存。2、显微镜直接计数法（1）镜检计数室
在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。（2）加样品
将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液（注意：要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生）（3）显微镜计数
5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。调节显微镜光线的强弱适当，对于用反光镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向一边，否则视野中不易看清楚计数室方格线，或只见竖线或只见横线。（4）清洗血细胞计数板
完毕后，将血细胞计数板在水龙头用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干，镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。
五、实验结果
1．菌体大小的测量
(1)目镜测微尺校正结果
(2)枯草芽孢杆菌测量结果（油镜观察，所得数据为所占格数）
(3)酿酒酵母测量结果（油镜观察，所得数据为所占格数）
(4)测量结果换算
2、显微镜直接计数法（血球计数板）结果
六、思考题
1．为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台微尺重新对目镜测微尺进行校正？答：因为目镜测微尺每格代表的长度与物镜倍数不是成比例的增加
2．在不改变目镜和物镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一株细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？
答：相同。因为改变物镜放大倍数后，只要经校正计算出正确的目镜测微尺每格代表的长度，再进行测量，经计算都会得到菌的实际大小。
3．根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面?应如何尽量减少误差．力求准确?
答：①样品的浓度要适中，太浓则不易计数，太稀也会导致计数不准确。另外稀释时要精确。
②样品稀释后要摇匀，否则计数板每个格内的细菌数菌量分布不均，会造成较大误差。
4．某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计1～2种可行的检测方法。
答：将干酵母粉制成酵母菌液，取少量菌液于试管内并加入少量美蓝染液进行混合，然后在血球计数板进行观察计数，算出所有死活菌的总数量，然后观察计数变蓝的死的菌量，两者比就是干酵母粉中的活菌存活率。
七、实验小结
本实验成功的关键是：
1.使用镜台测微尺进行校正时，若一时无法直接找到测微尺，可先对刻尺外的圆圈线进行准校后再通过移动标本推进器进行寻找。
2.细菌在不同的生长时期细胞大小有时会有较大变化，注意选择处于对数生长时期的细胞材料。
3.实验中进行显微计数时应先在低倍镜下寻找大方格的位置，找到计数室后将其移至视野中央，再换高倍镜观察和计数。
通过此次实验，我们了解了血细胞计数板的构造及计数原理，掌握了用测微尺测定微生物细胞大小和使用血细胞计数板进行微生物计数的方法，巩固了微生物实验技能。
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