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分子生物学实验讲义示例
CTAB法提取植物基因组DNA
【实验背景】
高等动物，高等植物的基因组相当庞大，一些物种的特定基因组包括了该物种生长，发育，繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量，因而对真核细胞基因组的结构，组成，以及表达调控的研究是至关重要的，而提取要求是获得纯度高和收得率高。
【实验目的】
1、掌握植物材料基因组DNA的CTAB法提取分离基本原理的方法；
2、掌握微量移液枪、液氮研磨、微量试管、高速离心机等使用操作技术。
【实验原理】
植物组织采用液氮研磨达到细胞破碎，细胞内容物采用CTAB分离蛋白质、多糖，再有苯酚、氯仿、异戊醇混合液萃取纯化，RNA由RNA酶消化，分离出的DNA由无水乙醇沉淀分离
【材料仪器】
材料：幼嫩的植物材料1.0g左右（红叶石楠）
仪器：移液枪、电子天平、恒温水浴箱、高速离心机、EP管、液氮、研磨等。
【实验试剂】
抽提缓冲液（2×CTAB溶液）：2％CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）、20mmol/LEDTA、1.4mol/L NaCL、1％β-巯基乙醇、
0.1％PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、100mmol/L Tris-HCl（pH=8.0） TE: 10Mm Tris-HCl（pH=8.0），1mM EDTA
其他试剂：液氮、RNA酶、氯仿、异戊醇、CTAB、无水乙醇、苯酚、EDTA等
【实验操作】
取1.0g植物材料，双蒸水洗净，并用滤纸吸干 植物材料剪成0.5cm左右碎片，放入预冷的瓷研磨中。 加入液氮速冷，研磨成细粉（越细越好）。
转入加有抽提缓冲液3.0ml的5ml离心管
60℃水浴保温1小时（不时转动试管）
分装成2个2.mlEP管，15,000 rpm，离心10分钟
取上清转入另一个新的离心管，加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），混合均匀抽提至水乳胶融状。
15,000 rpm离心5分钟
上清液转移到另一离心管中，加入0.8-1.0倍体积预冷异戊醇 ，-20℃保温30分钟－1小时，缓缓混匀DNA成絮状折出
15,000 rpm，离心5分钟，弃上清
DNA沉淀用冰冷的70％乙醇洗2次
挥发尽乙醇后，用200μl TE缓冲液溶解DNA，-20℃冻存。
【注意事项】
1、使用新鲜、幼嫩的材料，材料应适量。
2、如果样品容易呈粘稠状，可能含有较多的多糖。
3、如果样品溶液呈棕色，可能含有较多的酚类物质。
4、操作过程中避免剧烈振荡，器件、器皿和试剂需要高温灭菌。
【思考题】
1、为什么要用新鲜、幼嫩的植物组织材料？
2、为什么在操作过程中避免剧烈振荡？
3、为什么器件、器皿和试剂需要高温灭菌？
4、如何提高提取植物组织DNA的产量？
苯酚：作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。
氯仿：也可使蛋白质变性并加速有机相与液相分层。
异戊醇：有助于消除抽提过程中产生的气泡。
CTAB法原理 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来
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