浅谈RNA的生物合成

浅谈RNA的生物合成

　　核糖核酸（缩写为RNA，即Ribonucleic Acid），存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。下面跟着小编来看看浅谈RNA的生物合成吧！希望对你有所帮助。

　　生物界，RNA合成有两种方式：

　　一是DNA指导的RNA合成，也叫转录，此为生物体内的主要合成方式。

　　另一种是RNA指导的RNA合成(RNA-dependent RNA synthesis)，也叫RNA复制(RNA replication),由RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase)催化，常见于病毒，是逆转录病毒以外的RNA病毒在宿主细胞以病毒的单链RNA为模板合成RNA的方式。

　　重点内容

　　（一）掌握不对称转录、模板链和编码链的概念。

　　（二）掌握原核生物RNA聚合酶的全酶及核心酶的组成；熟悉模板与酶的辨认结合，启动子的概念。了解-35区、-10区、上游、下游序列等概念，以及两区的作用特点。

　　（三）熟悉原核生物的转录起始，转录的方向，原核生物的转录终止分两种方式。了解原核生物RNA合成的过程。

　　（四）熟悉真核生物的RNA聚合酶的分类，作用特点以及各自相应的产物；了解真核生物转录过程。

　　（五）掌握断裂基因、内含子、外显子的概念；

　　（六）熟悉真核生物mRNA,tRNA的修饰过程。

　　复制与转录的相同点：

　　①都是酶促的核苷酸聚合过程

　　②以DNA为模板

　　③遵循碱基配对原则

　　④都需依赖DNA的聚合酶

　　⑤聚合过程都是生成磷酸二酯键

　　⑥新链合成方向为5’→3’

　　原核生物转录的模板和酶

　　Section1Templates and Enzymesin Prokaryotic Transcription

　　原核生物转录的模板

　　DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因(structuralgene)。

　　转录的这种选择性称为不对称转录(asymmetric transcription)，它有两方面含义：

　　在DNA分子双链上，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录；

　　模板链并非总是在同一单链上。

　　全称：依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP）。

　　RNA合成的化学机制与DNA聚合酶催化DNA合成相似，沿5‘→3’聚合RNA。

　　两种酶的异同

　　引物酶催化转录的RNA-pol

　　共同点:本质上都是一种依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP）;

　　催化游离的NTP聚合。

　　区别:①复制起始时聚合短链RNA作

　　为引物，以提供3ˉ-OH末端，

　　使子代DNA链能够延长。

　　②dnaG基因编码，

　　③对利福平不敏感转录时催化子链延长对利福平敏感

　　DNA聚合酶在启动DNA链延长时需要引物存在，而RNA聚合酶不需要引物就能直接启动RNA链的延长。

　　RNA聚合酶和DNA的特殊序列——启动子(promoter)结合后，就能启动RNA合成。原核生物中的RNA聚合酶全酶由五个亚基构成，即**（ω），分子量达480kD。

　　亚基能引导RNA-pol稳定的结合在DNA启动子上。

　　亚基存在对核心酶的构象有较大影响，能导致RNA-pol与DNA上的一般序列和启动子序列的亲和力有很大不同：

　　极大降低了酶与DNA一般序列的结合常数，和停留时间，同时又增加了酶与启动子的亲合力和停留时间

　　其他原核生物的RNA聚合酶，在结构、组成、功能上均与E.coli相似。

　　抗结核药利福平或利福霉素可专一性地结合RNA聚合酶的β亚基，抑制RNA合成。原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。

　　启动子(启动序列，promoter)是RNA聚合酶结合并起动转录的特异DNA序列。启动子(promoter)是调控序列的一部分,控制转录的关键部位，决定着基因的表达强度。

　　原核生物RNA转录合成的过程

　　一、转录起始需要RNA聚合酶全酶

　　RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。

　　DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。

　　转录起始过程：

　　1.RNA聚合酶全酶与模板结合，形成闭合转录复合体(closed transcription complex)；

　　2.DNA双链局部解开，形成开放转录复合体(open transcription complex)；

　　3.第一个NTP加入，形成转录起始复合物：

　　DNA双链解开的范围只有≈17bp，比复制叉小得多。

　　转录起始生成RNA的5’总是GTP，且保留三个磷酸基团

　　第一个磷酸二酯键生成后，σ亚基即从转录起始复合物上脱落，核心酶连同四磷酸二核苷酸，继续结合于DNA模板上，酶沿DNA链前移，进入延长阶段。

　　二、原核生物的转录延长时蛋白质的翻译也同时进行

　　亚基脱落，RNA–pol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。

　　三、原核生物转录终止分为依赖ρ(Rho)因子与非依赖ρ因子两大类

　　转录终止指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。

　　依赖Rho(ρ)因子的转录终止

　　非依赖Rho因子的转录终止

　　（一）依赖ρ因子的转录终止

　　ρ因子是由相同亚基组成的六聚体蛋白质，亚基分子量46kD。

　　ρ因子能结合RNA，又以对polyC的结合力最强。

　　ρ因子还有ATP酶活性和解螺旋酶(helicase)的活性。

　　目前认为，ρ因子终止转录的作用是：与RNA转录产物结合，结合后ρ因子和RNA聚合酶都可发生构象变化，从而使RNA聚合酶停顿，解螺旋酶的活性使DNA/RNA杂化双链拆离，利于产物从转录复合物中释放。

　　（二）非依赖Rho因子的转录终止

　　DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。

　　终止点处存在相连的富含GC的回文结构，使RNA转录产物形成发夹形的二级结构，其后又有一段寡聚U

　　真核生物的转录过程

　　真核生物的转录过程比原核复杂。二者的转录起始过程有较大区别，转录终止也不相同。

　　一、真核生物有三种DNA依赖性RNA聚合酶

　　真核生物具有3种不同的RNA聚合酶:

　　RNA聚合酶Ⅰ（RNAPolⅠ）RNA聚合酶Ⅱ（RNAPolⅡ）RNA聚合酶Ⅲ（RNAPolⅢ）三种RNA聚合酶均由10～12个大小不同的亚基组成，结构复杂，功能上存在差异。

　　真核生物RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的结构比原核生物复杂，都由多个亚基组成。有些亚基是三种酶所共有。

　　所有真核生物的RNA聚合酶都有两个不同的大亚基和十几个小亚基.

　　mRNA是各种RNA中寿命最短、最不稳定的，需经常重新合成。因此RNA聚合酶Ⅱ是三种酶中最活跃的。

　　RNA聚合酶Ⅱ由12个亚基组成，其最大的亚基称为RBP1。

　　【拓展知识】

　　真核细胞rna提取的实验报告范文

　　一．原理

　　本方法利用盐酸胍抑制RNA酶，匀浆裂解细胞，采用有机溶剂抽提去除蛋白质。通过选择性沉淀RNA分子去除DNA。

　　二．方法

　　1.样品处理

　　⑴组织样品处理：取新鲜的组织样品称重后，剪碎成约1cm2的组织块直接加入匀浆液中进行RNA提取，或液氮中速冻-70℃保存。

　　⑵贴壁培养细胞处理：用PBS洗细胞一次，吸干溶液后将培养板快速移至液氮中冷冻后转到-70℃保存；或加入1ml匀浆至培养板中直接裂解细胞，然后将粘稠的裂解液进一步匀浆。

　　⑶悬浮培养细胞处理：离心收集细胞，用PHS悬浮漂洗再田心收集，若不立即提取RNA，则可经液氮速冻后转至一70℃贮存备用。

　　2．加l()倍体积盐酸胍匀浆液[至准备好的样品细胞中，高速匀浆1min。

　　3．匀浆液5000g，室温离心10min。

　　4．将上清移至一个干净离心管中，加入0.1体积的3mol／L乙酸钠（PH5.2），混匀，再加5体积预冷的乙醇，立即充分混匀，-20℃放置至少2小时。

　　5．5000g 0℃离心10分钟沉淀核酸，弃上清液，室温干燥。

　　6，每个提取RNA的组织或细胞样品中，加入l0～15min盐酸胍匀浆液Ⅱ，搅拌溶解。

　　7．加入2.5体积预冷的乙醇，立即充分混匀，-20℃至少放置2小时。

　　8．5000g 0℃离心10分钟沉淀核酸，去上清，室温挥发乙醇。

　　9．按每克组织细胞加5min的比例．分两次加入0.02mol／L EDTA(pH8.0) 先加1／2体积EDTA振荡l～2分钟，3000g离心2min．吸出上清．再加另一个1/2体积的EDTA振荡l一2分钟．合并两次核酸溶解液。．

　　10．用等体积氯仿—正丁醇(4：1)抽提核酸溶液，5000g室温离心l0min，5000g室温离心10min。吸出上清至另一个干净离心管中。

　　11．加3倍体积lmol／L乙酸钠 (PH7.0) 混匀，-20℃放置1h以上，此时RNA将选择地沉淀，而DNA仍为溶解状况。

　　12．5000g，0℃离心20min，沉于管底的是RNA。

　　13．吸去上清，用4℃预冷的lmol／L乙酸钠(pH7．0)漂洗RNA沉淀。然后20℃ 5000g，离心20分钟。回收RNA。

　　14．尽量去除上清液。按每g组织细胞1m的比例加入RNA溶解液(0.2％SDS，0.5％mol／L EDTA，pH8.0)。注意：若有SDS沉淀析出．滴加0.11mol／L NaOH调溶液pH至7．5。

　　15．加入2倍体积冰预冷乙醇混匀，0℃放置至少2小时，5000g，4℃离心10分钟，RNA沉淀用70％乙醇漂洗，短暂离心后，弃上清，室温干燥蒸发乙醇。

　　16．用适当小容积DEPC处理过的ddH2O溶解RNA沉淀，加入3倍体积乙醇，

　　-70℃保存RNA备用。用时．加入0.1体积的3mol／L乙酸钠，混匀，12000g，4℃离心回收RNA。

　　三.试剂

　　1．盐酸胍匀浆液Ⅰ

　　成分：8mol／L盐酸胍(分子量为95.6)，O．1mol／L乙酸钠(pH5．2)，5mmol／L 2—巯基乙醇，0.5％十二烷基肌氨酸钠

　　配制方法：取191g盐酸胍．加8.35m1 3mol／L乙酸钠(pH5．2)和6．25ml 0．2mol／L 2—琉基乙醇溶液中，再加水至237．5ml，混匀后加12．5ml 10％十二烷基肌氨酸钠,振荡混匀溶解。

　　2．盐酸胍匀浆液Ⅱ

　　成分：8mol／L盐酸胍(分子量力95.6),0.1mol／L乙酸钠(pH5．2),1mmol／L 2

　　—琉基乙醇，20mmol／L EDTA(pH8.0)

　　配制方法：取191g盐酸胍，加日．35ml 3mol／I。乙酸钠(pH5．2)和1．25ml 0．2mol

　　／L 2—巯基乙醇溶液中，再加入10ml 0.5mol／L EDTA(pH8.0)。加水至250ml混匀。

　　3.乙醇

　　4.70％乙醇

　　5.氯仿—正丁醇(4：l，体积比)

　　6.4mol／L乙醇钠，pH7.0

　　7.3mol／L乙醇钠，pH5.2

　　8.RNA溶解液

　　成分：O．2％SDS．0.05mol／L EDTA, pH8.0

　　四、说明

　　提取RNA时，要特别注意防止RNase的污染，所用玻璃器皿均应用0.1％的二乙基焦碳酸盐(diethyl pyrocarbonate，DEPC)处理。塑料器材均使用一次性用品，并高压灭菌处理，必要时，也可用0.1%DEPC处理。