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添加琼脂改善木薯和糖蜜机械搅拌发酵制备细菌纤维素的探究论文
细菌纤维素（bacterial cellulose，BC）是一种具有纳米纤维结构的微生物胞外聚合物，具有独特的理化性质和力学性能，如极强的持水性、高结晶度与高拉伸强度以及生物可降解性。基于以上性能 BC 在许多领域具有应用潜力，如保健食品、功能性纸张、纺织品、功能性材料、以及包括伤科敷料和人工血管在内的生物医学材料等。自然界中，能够生产细菌纤维素的微生物包括醋酸杆菌属、根瘤菌属、土壤杆菌属、八叠球菌属等。目前利用椰子水和木葡糖醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus）在静态培养条件下已实现工业化生产，但是存在以下问题：1）由于近年对 BC 的市场需求越来越大，椰子水资源已显匮乏；2）静态生产的低效和高成本极大地限制了 BC 的大规模生产与商业应用。为了寻找新的价廉量大的生产原料以及提高效率和降低生产成本，研究者尝试开发许多资源丰富的生物质资源和利用发酵罐动态生产。近期报道的生物质资源包括魔芋粉、麦秸、稻秆、废弃棉织物、废纸浆和云杉等。
木薯（Cassava）是一种多年生木本灌木，其块根呈肉质，含有丰富的淀粉，作为经济类作物，主要用于加工淀粉和家用饲料。随着国家能源战略的实施，近年来木薯的应用结构发生了很大的变化，应用于工业发酵中的比例迅速增加，特别是用于燃料乙醇的生产。糖蜜（Molasses）是制糖工业的副产物，呈黑褐色，组成成分中大部分为可发酵性糖。常见的糖蜜主要有甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、葡萄糖蜜以及玉米糖蜜等。虽然糖蜜中含糖量较高，但是其干物质浓度大，灰分与胶体物质多，所以在发酵应用前需要进行预处理，如硫酸预处理能使甜菜糖蜜的发酵产量得到明显提高。前期工作中，本团队曾尝试利用糖蜜静态发酵制备细菌纤维素并获成功。
目前生产细菌纤维素的主要方法为静态培养，但是该法生产效率低，仅适合膜状纤维素的小规模生产。相对而言，常规的机械搅拌发酵动态培养可以控制多个参数，易于优化工艺流程，更适合工业化生产，且易于在发酵企业推广。但是机械搅拌发酵过程 中菌体对搅拌叶轮剪切力的高度敏感性，易变异退化，为此本团队曾报道了剪切力对木葡糖醋杆菌及细菌纤维素合成的影响。由此可见发酵过程中，剪切力与溶氧是影响菌体发酵效果的重要因素，剪切力小且溶氧率大是细菌纤维素生产菌的较佳发酵环境。常规液体深层机械搅拌发酵中若要增加溶氧，一般常用的增加转速会带来高剪切力，因此在剪切力与溶氧之间需要寻找到一个平衡点。本文分别以糖蜜与木薯为发酵碳源，考虑通过添加琼脂来增加发酵液粘度以减小剪切力，在 3 L 机械搅拌发酵罐中研究不同浓度琼脂对细菌纤维素生产的影响。
1 实验
1.1 菌体与原料
所用菌株 Gluconacetobacter xylinus ATCC 23770 由本实验室保藏。接种在装有固体培养基的试管中放于 4℃的冰箱中存放。使用时挑取菌落一环，置于三角瓶液体培养基中，于 30℃摇床 160 r/min 活化。木薯（华南五号）和糖蜜均购自中国广西。
1.2 原料预处理
糖蜜预处理（采用酸―热处理法）：按糖蜜与去离子水 1∶4（w/w）的比例配置成约 1 L 糖蜜水溶液，经 4 mol/LH2SO4调 pH 值至 3，在 120℃温度下热处理 20 min，过夜，6 000 r/min 离心 20 min 后得到糖蜜预处理液。
木薯酶解液（采用两步酶解法）：按去皮切块的新鲜木薯与去离子水 1∶1.5（w/V）的比例加入高速粉碎机，在 22 000 r/min 速度下匀浆粉碎 5 min，先经高温α-淀粉酶水解（水解条件为酶用量 123 U/g、pH6.0、87.4℃、53 min）；待酶解液温度降至室温后再进行糖化酶水解（水解条件为酶用量 133 U/g、pH4.5、62.2℃、86 min）。酶解完成后用干净的八层纱布进行过滤，滤液在 6 000 r/min 条件下离心 20 min，收集上清液，即得到木薯酶解液，以 DNS 法测定还原糖含量，并根据浓度进一步配置发酵培养基。
1.3 培养基
斜面培养基包括葡萄糖 25 g/L、蛋白胨 5 g/L、酵母粉 3 g/L、琼脂 18 g/L。种子培养基除了不含琼脂外，其它组分同斜面培养基。
糖蜜发酵培养基包括糖蜜预处理液 40 g/L（以还原糖计）、蛋白胨 5 g/L、酵母粉 3 g/L。木薯发酵培养基包括木薯酶解液 40 g/L（以还原糖计）、蛋白胨 5 g/L、酵母粉 3 g/L。
所有培养基的初始 pH 值用 1 mol/L 硫酸和 1 mol/L 氢氧化钠调至 5.0，并在 121℃下灭菌 20 min。
1.4 发酵罐培养
实验所用的 3 L 机械搅拌式发酵罐由上海保兴生物设备工程有限公司加工制造，该设备配有两个挡板，有效工作体积 2 L，装有两个四叶斜桨（直径 5 cm，上下共两个，相距 10 cm），并配有溶氧电极（梅特勒-托利多公司）、pH 电极（梅特勒-托利多公司）和温度电极，以及原位活细胞浓度在线分析仪（英国 Aberinstruments 公司），分别用于测定溶解氧、pH 值、温度和活菌浓度。
1.5 细菌纤维素的处理与测定
发酵液样品经过离心后，上清液用于测定还原糖含量，而含有絮状纤维素的沉淀物用 1 mol/L NaOH在 85℃水浴锅中碱煮 20 min，4 000 r/min 离心 15 min，然后用去离子水洗涤，再次离心，上述步骤重复两次以去除纤维素中的菌体和残留的培养基。
2 结果与讨论
2.1 以木薯为原料添加琼脂对细菌纤维素生产的影响
每12 h取样测得的纤维素产量随发酵时间的变化趋势，图3为发酵结束最终放罐的纤维素产量。图 2 显示当发酵液中加入 0.2%的琼脂时，纤维素合成速度最快，产量最高，在前 24 h 产量缓慢增长，24 h后产量开始迅速增加，72 h后增长放缓，96 h后纤维素产量基本不再增加，至发酵末纤维素产量达到7.3 g/L。加入 0.4%琼脂的发酵液生产细菌纤维素的速度也较快，产量仅次于前者。未加入琼脂的发酵液无论合成纤维素的速度还是产量都是最低的，发酵产量由低到高依次为 0.0%＜0.8%＜0.6%＜0.4%＜0.2%，合成的纤维素产量依次为 6.1、6.5、6.8、6.9 和 7.3 g/L。该结果说明适量的添加琼脂可以提高纤维素的合成产量，但是随着琼脂量的增多，发酵液粘度可能过大会影响菌体的生长，不利于纤维素的合成。由于发酵过程中絮状纤维素会贴附在发酵罐内壁以及叶片上导致纤维素产量的数据失真，所以在发酵结束后测定整体发酵液中的纤维素产量。
2.2 以糖蜜为原料添加琼脂对细菌纤维素生产的影响
给出了纤维素产量随时间的变化曲线。由图 6 可知，在前 12 h 纤维素基本没有合成，12 h 后开始缓慢合成，24 h 后合成速度加快，纤维素产量显著提高，在 72 h 后纤维素的合成开始放缓，表明菌体已处于稳定期至衰退期的过渡态，之后纤维素产量并未有明显的增加。从单个曲线来看，加入 0.6%琼脂的发酵液中纤维素产量在 48 h 后明显高于其他组，最高产量达 6.5 g/L 左右，其次加入 0.4%与 0.8%琼脂的发酵液中纤维素合成速度与终产量基本一致，没有明显的差异，而未加琼脂发酵液中的纤维素产量从发酵初始至发酵终止一直落后于其他组，最终产量达 4.5 g/L 左右。可见琼脂的加入能使最终发酵产量明显提高，与木薯的结果一致。发酵最终的纤维素产量，从高到低依次为 0.6%＞0.4%＞0.8%＞0.2%＞0.0%，产量依次为 7.4、6.3、6.0、5.7 和 4.8 g/L。
2.3 木薯与糖蜜发酵结果的比较
从单个碳源的发酵结果来看，木薯发酵液中当加入 0.2%～0.6%的琼脂时，无论从 BC 得率、产率还是菌浓等指标来看，发酵结果都是最优的，加入琼脂后的发酵液中菌体生长比添加前明显加速，纤维素产量提高。糖蜜发酵液中当加入 0.4%～0.8%的琼脂后，各项发酵指标均明显提高，菌体浓度接近 2.0×106cells/mL，而未加琼脂的发酵效果不理想，各项指标均低于其它各组。剪切力是动态发酵过程中的关键因素之一，增加发酵液粘度可以降低剪切力。Kouda 等在发酵液中添加了1%的 BC 悬浮物增加发酵液粘度后，BC 产量显著增加。Bae 等在玉米浆―果糖培养基中添加琼脂，结果显示当加入 0.4%的琼脂时 BC 产量最大，由未加入琼脂的 8 g/L 提高到 12.8 g/L。
将两种碳源进行对比可以发现，木薯的发酵性能明显优于糖蜜，菌浓基本都在 2.0×106cells/mL 以上，而糖蜜发酵液的菌浓则基本处于 2.0×106cells/mL 之下。终点糖浓也清晰的反映了这一问题，木薯发酵终点糖浓基本处于 12～14 g/L 之间，而糖蜜发酵终点糖浓处于 14～20 g/L 之间，明显高于前者，说明糖蜜发酵的还原糖转化率不高，因此纤维素合成量低于前者。两种原料发酵结果的显著差异可能在于糖蜜作为一种工业废料，其中掺杂了大量的色素以及其它抑制物，一定程度上抑制了菌体的生长。这需要在糖蜜预处理中进行针对性设计和优化。
3 结论
在机械搅拌式发酵罐中，分别以相同还原糖浓度的木薯酶解液和糖蜜处理液作为发酵碳源，结果发现木薯水解液的发酵性能优于糖蜜，BC 产量约高出 5%。为降低机械搅拌的剪切力，添加琼脂可以改善木醋杆菌的生长，显著提高细菌纤维素的产量。0.2%和 0.6% 分别是木薯水解液和糖蜜处理液的最佳琼脂添加量，BC 产量可以分别达到 8.1 g/L 和 7.4 g/L。
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