生物实验常见问题

生物实验常见问题

　　1、有关NaN3的问题：

生物实验常见问题

　　A:我看到一篇用流式测细胞表面CD11b的论文，加入抗体后用含0.1%叠氮钠的PBS悬浮细胞，然后上流式细胞仪检测。我不太明白PBS中加入叠氮钠起什么作用。答：叠氮钠是一种防腐剂，防止细菌增生，在这里的目的是保护仪器。

　　注意，剧毒物。

　　B:在rna纯化提取中洗脱液里含有的“NaN3”是什么作用?

　　答：提取后的RNA需要保存，需要加防腐剂，NaN3-叠氮钠是比较合适的试剂，用万分之五或千分之一就可以起到良好效果。

　　2、有关Elisa类问题：

　　A）为什么要选择聚苯乙烯材料；

　　答：聚苯乙烯材料能吸附蛋白质。

　　B）我们一般用HIVHCV人IgG和HBsAg来包被，为什么选择这几种；

　　答：选择什么包被取决于你要检测什么，是抗原还是抗体。我们一般用HIVHCV人IgG包被来检测HIVHCV的病毒抗原。用HBsAg包被，来检测抗HBsAg抗体。

　　C）配置的时候用CB和抗原按比例配，CB起到什么作用，最重要的作用是什么

　　答：CB是碳酸盐缓冲液吧，在pH9.6的碳酸盐缓冲液中，蛋白质能吸附在聚苯乙烯表面。

　　D）洗去包被液的时候需要封闭，只要起到什么作用；

　　答：封闭的作用是封闭非特异性结合位点；防止抗原或抗体的非特异性吸附。

　　E）封闭后做实验的时候家的是相对的`抗体吗？是什么方法？夹心法还是什么方法？我知道部是竞争法呵呵；

　　答：封闭后加的东西取决于试验方法；间接法一般是抗体，双抗夹心法一般是抗原。F.)CB包被液配置为什么选用这几种试剂（Na2CO3NaHCO3NaN3）；封闭液起到什么作用？包被的是抗原吧？

　　答：Na2CO3NaHCO3是配制碳酸盐缓冲液的一对缓冲试剂，NaN3是防腐作用。

　　封闭液的作用是封闭非特性吸附位点。一般含有动物血清或BSA.包被即可能是抗原也可能是抗体，看你要测什么，选什么方法。

　　3、有关细胞免疫荧光

　　A、步骤：

　　1、固定：PBS5min×3次振荡洗涤制作好的细胞爬片。固定液覆盖细胞，RT静置15min。PBS5min×3次振荡洗涤。

　　2、通透化：通透液覆盖细胞，RT静置30min。PBS5min×3次振荡洗涤。

　　3、封闭：封闭液覆盖标本表面37℃孵育1h。

　　4、一抗孵育：一抗以合适浓度稀释PBS，覆盖标本表面。4℃孵育过夜，第二天37℃复温1h。PBS5min×3次振荡洗涤。

　　5、二抗孵育：FITC标记二抗以合适浓度稀释于PBS，覆盖标本表面。37℃避光孵育<60min。PBS5min×3次避光振荡洗涤。

　　6、染核：新鲜稀释Hoechst覆盖细胞表面，RT避光静置<10min。PBS5min×3次避光振荡洗涤。

　　7、封片：在干净的载玻片上滴一滴封片剂，将爬片的细胞面扣在封片剂上。

　　8、镜检，4℃避光保存。

　　注：1、细胞密度要合适，状态较好。2、从孵育二抗开始要避光（关闭室内日光灯

即可）。

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