甲氨蝶呤/锌铝层状双氢氧化物的合成以及生物效应探究论文

甲氨蝶呤/锌铝层状双氢氧化物的合成以及生物效应探究论文

　　1 引言

　　水滑石类化合物包括水滑石和类水滑石 因其主体一般由两种金属的氢氧化物构成, 故又称为层状双金属氢氧化物(layered double hydroxides, LDHs). LDHs的化学通式可表示为: [M2+1?xM3+x(OH)2][An?]x/n·mH2O,其中 M2+表示+2 价金属离子, M3+表示+3 价金属离子,A 表示层间阴离子, m 为层间水分子的摩尔数[ 1].LDHs 的层间阴离子具有可交换性, 因此, 可将各种阴离子, 如有机、无机、中性分子、酶及其他生物药物分子等组装到 LDHs 层间, 进而得到具有不同性能的复合材料. 此外, LDHs 独特的层板结构能够有地保护插入其中的分子或离子. 大量的研究证明,药物/LDHs 纳米复合物的合成不仅可以降低药物的毒副作用, 提高药物的安全性、有效性, 还可提高药物的溶解度和稳定性, 控制药物释放速率. 因此, 近年来, 将客体药物组装到 LDHs 层间制得药物/LDHs纳米复合物的研究受到生物、医学和材料界的广泛关注. 北京化工大学段雪等研究了多种生物药物插层 LDHs 层间的结构、性能以及药物释放的缓释性能等. 山东大学侯万国等选用萘普生为模型药物分子, Zn-Al-LDHs 为载体, 合成了萘普生/LDHs, 又采用结构重组法制备了非离子型、水溶性差的抗癌药物喜树碱(CPT)/LDHs。

　　甲氨蝶呤(MTX)是一类抗叶酸类抗肿瘤药, 主要通过对二氢叶酸还原酶的抑制达到阻碍肿瘤细胞DNA 的合成 , 从而遏制肿瘤细胞的生长与繁殖 .MTX 是治疗类风湿关节炎的主要药物, 近年来也被用于治疗系统性红斑狼. 但 MTX 具有体内半衰期短、组织分布广泛、不良反应严重及器官靶向性差等缺点. 研究表明, MTX 组装到 LDHs 层间形成 MTX/LDHs 纳米复合物后, 不仅能有效改善这些不足, 而且能明显增强药物的稳定性, 提高药效. 目前, 制备 MTX/LDHs 的方法有共沉淀法、离子交换法、机械化学法、水热法、成核-晶化法和焙烧还原法等.Choy 等采用共沉淀法成功合成了MTX/LDHs纳米复合材料, 并分别将 MTX 和 MTX/LDHs作用于人类骨肉瘤细胞(SaOS-2). 结果发现, MTX/LDHs 抑制肿瘤细胞生长的效率远远高于纯 MTX, 且体内释放半衰期延长、器官靶向性增强, 同时证明了 MTX/LDHs 在小剂量时仍具有很高的药效, 其药效比纯MTX 高 5000 多倍。

　　2 实验部分

　　2.1 试剂与仪器

　　硝酸锌(Zn(NO3)2·6H2O, A.R., 广东汕头市西陇化工厂有限公司), 硝酸铝(Al(NO3)3·9H2O, A.R., 上海新宝精细化工厂), 氢氧化钠(NaOH, A.R., 上海国药集团化学试剂有限公司), 氨水(NH3·H2O, A.R., 上海化学试剂有限公司), 乙醇(C2H5OH, A.R., 上海国药集团化学试剂有限公司), 磷酸二氢钾(KH2PO4,A.R., 上海凌峰化学试剂有限公司), 甲氨蝶呤(MTX,A.R., 浙江省湖州展望药业有限公司 ), 二甲亚砜(DMSO, A.R., 生工生物工程股份有限公司), 小牛血清(BB001, 生工生物工程股份有限公司), DMEM 培养基(BC002, 生工生物工程股份有限公司), MTT(T0793, 生工生物工程股份有限公司 ), 胰蛋白酶(PB068, 生工生物工程股份有限公司). 实验用水均为去离子水。

　　2.2 改进的共沉淀法合成 MTX/LDHs 纳米复合物

　　称取 0.8924 g Zn(NO3)2·9H2O 和 0.5627gAl(NO3)3·9H2O 并溶于乙醇/水(1:3, 体积比)溶液中,配成混合盐溶液 A; 称取一定量的 MTX (0.2045、0.2727、0.3408 和 0.4089 g, 使得 Zn2+/Al3+/MTX 摩尔比分别为 R = 2:1:0.3、2:1:0.4、2:1:0.5 和 2:1:0.6)溶于8 mL 5%的氨水中, 配成溶液 B; 将 B 溶液转移至三颈烧瓶中, 恒定 60℃温度下磁力搅拌并通入 N2, 采用 pH 下降法以 0.1 mL/s 的速度滴加溶液 A, 用 25%的氨水调节混合溶液的 pH 为 8.5, 60℃下反应1 h. 最后, 用去离子水和乙醇交替离心洗涤 3 次(离心速度为 10000 r/min, 离心时间为 1 min). 合成的产物放至 50 mL 的高压反应釜(内衬为聚四氟乙烯)中, 经100℃、24 h 的水热处理后即制备出 MTX/LDHs 纳米复合物. 作为对比, 采用同样方法, 不加药物合成了Zn-Al-LDHs 母体。

　　2.3 缓释性能的研究

　　准确称取 0.01 g MTX/LDHs 溶解在 50 mL pH1.2 的 HCl 溶液中, 用移液管取容量瓶中 5 mL 溶液置于 50 mL 容量瓶中, 加入 45 mL HCl 定容, 所得溶液浓度约为 20 μg/mL. 用紫外-可见分光光度计在 306nm 处测定其吸光度, 并根据标准曲线计算 MTX 浓度,求出载药量. 再根据载药量计算缓释实验所需要的MTX/LDHs 纳米复合物的量, 称取后溶解于 pH 7.4(500 mL)的磷酸盐缓冲溶液(按照中国药典 2005 年版第二部附录 XIVE 方法进行配制)中, 在 37 ± 0.5℃下恒温搅拌. 于预设定的时间间隔内, 取 3 mL 溶液高速离心分离, 取上清液用紫外-可见分光光度计在306 nm 处测量其吸光度, 根据标准曲线计算出相应的 MTX 浓度和释放率, 并绘制出 MTX 的累积释放曲线.

　　2.4 采用 MTT 法初步研究 MTX/LDHs 对肺癌A549 细胞的增殖抑制作用

　　人肺癌细胞株 A549 购自上海细胞库, 用含 10%小牛血清、100 U/mL 青霉素和链霉素的 DMEM 培养基, 于 37℃、5% CO2恒温培养箱内培养. 将人肺癌A549 细胞接种于 100 mL 的培养瓶中, 培养基为含有10%小牛血清的 DMEM, 置于 37℃、5% CO2恒温培养箱内培养箱孵育, 细胞为贴壁生长, 用显微镜观测待细胞长满培养瓶的 70%~80%, 用 0.25%的胰蛋白酶消化, 传代. 用 10% DMEM 稀释细胞悬液, 并接种到 96 孔板, 每孔体积 100 μL. 正常培养 24 h 后吸走废液, 加入不同浓度的MTX和MTX/LDHs (如20、40、60、80 和 120 μg/mL), 每组设 6 孔重复, 对照组加 100 μL DMEM (无血清). 分别培养 24 h 后弃除 96孔板中的残药和 DMEM, 每孔加入新鲜 DMEM (无血清) 90 μL 和 MTT 10 μL (5 mg/mL, pH 7.4 的 PBS配制), 继续培养 4 h 后, 终止培养。

　　3 结果与讨论

　　3.1 FT-IR 分析

　　在不同 R 值条件下合成的 MTX/Zn-Al-LDHs 纳米复合物的红外光谱图, 分子振动光谱常用于研究客体分子与主体层板、层间水等之间的作用力.从图中可看出, 所有复合物红外峰的峰型与峰位非常相似, 且与 MTX 红外峰位置基本相同. 此外, 母体 NO3?-LDHs 的红外光谱也标示于图中. 可以看出,NO3?-LDHs 的红外谱图与复合物有明显不同. 对于母体 LDHs, 3430 cm?1处的峰对应 LDHs 层板上和层间水分子的 OH?伸缩振动, 1637 cm?1处的峰对应层间水分子的变角振动, 而 1386 cm?1处的峰则对应NO3?的吸收振动. 对于 MTX/LDHs 复合物, 1386cm?1处的吸收峰明显变弱, 说明 MTX 已经取代了层间大部分的 NO3, 这说明, 在反应中 NO3?与层板间强烈的静电作用使部分 NO3?不易除去. MTX 的红外光谱中, 1638 和 1508 cm?1处的峰分别对应 COO?的不对称及对称伸缩振动, 当 MTX 插层到 LDHs 层间后, 这两个峰分别红移至 1614 和 1450 cm?1处. 这是因为在碱性环境中, MTX 末端的–COOH 电离为COO?, 带负电的 MTX 阴离子与带正电的 LDHs 发生强烈的静电作用使得 COO?的不对称和对称伸缩振动峰发生了红移. 以上结果均表明, MTX 组装到LDHs 层间后, 二者之间的相互作用使得 MTX 吸收峰位置和强度均发生了变化。

　　4 结论

　　本文采用共沉淀法合成了不同 MTX/Zn-Al-LDHs 纳米复合物, 并考察其缓释性能和癌细胞活性检测. 研究结果表明, 合成粒子的粒径会随 R 值的增大而减小. 缓释实验结果表明, 4 种样品均具有明显的缓释性能, 缓释曲线平稳. 用 modified Freundlich模型和 parabolic-diffusion 模型进行了分步动力学模拟, 分析结果表明, MTX/Zn-Al-LDHs 纳米复合物最初的释药过程属于表面药物的扩散, 随后的释放属于粒内扩散占主导的多相扩散过程. 生物细胞活性实验的研究表明, MTX/LDHs 较纯的 MTX 具有更好的抑制癌细胞增殖的作用, 在一定范围内, 其抑制作用随着粒径的减小而增强。

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