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微生物学实验讲义

时间：2022-07-04 14:09:08 生物/化工/环保/能源我要投稿

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微生物学实验讲义

　　微生物学实验篇一：微生物学实验讲义(基础)

　　微生物学类实验讲义

微生物学实验讲义

　　(适用专业：生物工程、生物技术、生物科学)

　　北方民族大学生物科学与工程学院

　　2010年制定

　　1实验目录

　　微生物学实验规则和安全……………………………………3

　　实验一微生物学实验基本知识与准备………………………………5

　　实验二实验三实验四实验五实验六实验七实验八实验九实验十显微镜油镜的使用与细菌染色…………………………………10

　　细菌芽孢、荚膜的染色及其认识………………………………17

　　显微镜测微技术及细菌运动性观察……………………………19

　　酵母菌个体、群体形态观察，血球板显微镜计数技术…22

　　放线菌个体、群体形态观察……………………………………24

　　霉菌个体、群体形态观察………………………………………25

　　培养基的配制及湿热灭菌，玻璃器皿的干热灭菌……………27

　　微生物的分离与纯化……………………………………………31

　　理化因素对微生物生长的影响，生长谱法测定微生物营养要求……33

　　2微生物学实验规则和安全

　　普通微生物学实验课的目的是：训练学生掌握微生物学最基本的操作技能，了解微生物学的基本知识，加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验，培养学生观察、思考、提出问题、分析问题和解决问题的能力，实事求是、严肃认真的科学态度以及敢于创新的开拓精神；树立勤俭节约、爱护公物的`良好作风。

　　微生物学实验室是一个严肃的实验场所，虽然普通微生物学实验所用的微生物材料一般为非致病菌或条件致病菌，但许多微生物是否具有致病性不是绝对的，与其数量、条件、感染途径等有关，所以在实验操作中，必须将所有的微生物培养物都看成是具有潜在致病性的。

　　3为了上好微生物学实验课，并保证安全，特制定如下规则和安全措施：

　　1．每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。

　　2．在整个实验过程中必须穿上实验服，留长发者，必须将长发挽在背后。实验台上除了记录本和笔(记录笔和记号笔)以外，不准堆放任何个人物品。

　　3．认真及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。

　　4．实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。

　　5．实验时小心仔细，全部操作应严格按照操作规程进行，禁止用嘴吸取菌液或试剂，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤破伤等意外情况发生时，应立即报告指导教师，及时处理，切勿隐瞒。

　　6．实验过程中，切勿使乙醇(酒精)乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火器。

　　7．使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。显微镜的目镜在使用前后必须用浸有乙醇(酒精)的透镜纸擦净。对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放回原处，严禁将药匙交叉使用。

　　8．每次实验完毕后，必须把所用仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3%来苏尔液或5%石炭酸液覆盖半小时后擦去，如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具(如吸管、玻璃刮棒等)在洗涤前须浸泡在3%来苏尔液中进行消毒。

　　9．每次实验需进行培养的材料，应标明自己的组别及处理方法，放于教师指定的地点进行培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。

　　10．每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告表格中，力求简明准确，认真回答思考题，并及时汇交教师批阅。

　　11．离开实验室前将手洗净，注意关闭门窗、灯、火、煤气等。

　　4实验一微生物学实验基本知识与准备

　　一、目的要求

　　1．了解微生物学实验基本概念，认识微生物学实验基本材料。

　　2．熟悉微生物实验所需各种常用器皿的名称和规格。

　　3．学会正确的清洗玻璃器皿的方法和包扎方法，为实验做准备。

　　4．熟读与牢记微生物学实验规则和安全。

　　二、实验原理

　　为了保证实验顺利进行，要求把实验所用器皿清洗干净，保持灭菌后无菌状态，需要对培养皿、吸管等进行妥善包扎，试管和三角瓶要做棉塞。清洗方法根据实验目的、器皿的种类、所盛放的物品、洗净剂的类别和沾污程度等的不同而有所不同，不同的器皿包扎方法也不同。

　　三、实验器材

　　1．常用的各种玻璃器皿(三角瓶、移液管、试管、吸管、培养皿、玻片)。

　　2．洗涤工具和去污粉、肥皂、洗涤液。

　　3．接种工具、棉花、纱布、棉线等。

　　四、操作步骤(一)玻璃器皿的认识

　　1．试管：微生物实验室所用的玻璃试管，根据其大小和用途不同，有下列三种型号：

　　(1)大试管(约18mm×180mm)：可装倒平板用的培养基，也可作制备斜面用(需要大量菌体时用)和装液体培养基用于微生物的振荡培养。

　　(2)中试管[(13～15)mm×(100～150)mm]：装液体培养基培养细菌或做斜面用，也可用于细菌、霉菌、病毒等的稀释和血清学试验。

　　(3)小试管[(10～12)mm×100mm]：一般用于糖发酵或血清学试验，和其它需要节省材料的试验。

　　2．德汉氏小管

　　观察细菌在糖发酵培养基内是否产气时，在小试管内倒置一小套管(约6mm×36mm)(图1)，此小套管即德汉氏小管，又称发酵小倒管。

　　3．小塑料离心管

　　微生物学实验篇二：微生物学实验

　　实验一、实验室和人体表面微生物的检查

　　一实验目的

　　1证明实验室环境与体表存在微生物

　　2比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型

　　3体会无菌操作的重要性

　　二实验原理

　　平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在适宜温度下培养，1-2d内每一菌体能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小、表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑等。因此可通过平板培养基来检查环境中微生物的数量和类型。

　　三、器材

　　1、培养基牛肉膏蛋白胨琼脂平板

　　2、仪器或其他用具无菌水、灭菌棉签（装在试管内），接种环，试管架，酒精灯，记号笔，废物缸。

　　四、操作步骤

　　1、写标签

　　任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号（包括班级、姓名、日期、样品来源等），字尽量小些，写在皿底的一边，不要写在当中，以免影响观察结果。

　　注：培养皿的记号一般写在皿底上，如果写在皿盖上，同时观察两个以上培养皿的结果，打开皿盖时容易混淆。

　　2、实验室细菌检查

　　（1）空气

　　将一个肉膏蛋白胨琼脂平板放在实验台上，移去皿盖，使琼脂培养基表面暴露在空气中，将另一块肉膏蛋白胨琼脂平板放在洁净工作台内或无人走动的实验室中，移去皿盖，1h后盖上两个皿盖。

　　（2）实验台

　　①用记号笔在皿底外面中央画一直线，再在此线中间处画一垂直线。

　　②取棉签

　　左手拿含有棉签的试管，在火焰旁用右手的手掌边缘和小指、无名指夹持棉塞，将其取出，将管口很快地通过酒精灯的火焰，烧灼管口；轻轻地倾斜试管，用右手的拇指和食指将棉签小心地取出。放回棉塞，并将空试管放在试管架上。

　　③弄湿棉签

　　左手取灭菌水试管，如上法拔出棉塞并烧灼管口，将棉签插入水中，再提出水面，在管壁上挤压一下以除去过多的水分，小心将棉签取出，烧灼管口，放回棉塞，并将灭菌水试管放在试管架上。

　　④取样将湿棉签在实验台面或门旋钮上擦拭约2cm2的范围。

　　⑤接种在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿开启成一缝。再将棉签伸入，在琼脂表面顶端接种（滚动一下），立即闭合皿盖。将原放棉签的空试管拔出棉塞，烧灼管口，插入用过的棉签，将试管放回试管架。

　　⑥划线

　　另取接种环在火焰上灭菌，先将环端烧热，然后将接种环提起垂直放在火焰上，以使火焰接触金属丝的范围广一些，待接种环烧红，再将接种环斜放，沿环向上，烧至可能碰到培养皿的部分，再移向环端，如此很快地来回通过火焰数次。

　　左手拿起平板，同样开启一缝，将灭过菌并冷却了的接种环（可在琼脂表面边缘空白处试温度，若发出溅泼声，表示太烫），通过琼脂顶端的接种区，向下划线，直到平板的一半处。注意：接种环与琼脂表面的角度要小，移动的压力不能太大，否则会刺破琼脂。

　　闭合皿盖，左手将平板向左转动至空白处，右手拿的接种环再在火焰上烧灼，使冷。接种环通过前面划的线条再在琼脂的另一半，从上向下来回划线至1／2处。

　　烧灼接种环，转动平板，划最后1／4，立刻盖上皿盖，烧灼接种环，放回原处。

　　整个划线操作均要求无菌操作，即靠近火焰，而且动作要快。

　　3、人体细菌的检查

　　（1）手指（洗手前与洗手后）

　　（2）鼻腔按照实验台检查法的步骤②，取出棉签，并将其弄湿。用湿棉签在鼻腔内滚动数次，按实验台检查法的步骤⑤和⑥接种与划线，然后盖上皿盖。

　　4、将所有的琼脂平板翻转，使皿底朝上，放37℃培养箱，培养1-2d

　　5、结果记录方法

　　（1）菌落计数在划线的平板上，如果菌落很多而重叠，则数平板最后1/4面积内的菌落数，不是划线的平板，也一分为四，数1/4面积的菌落数。

　　（2）根据菌落大小、形状、高度、干湿等特征观察不同的菌落类型。

　　菌落特征：大小、颜色、干湿情况、形态、高度、透明程度、边缘。

　　菌落特征描写方法如下：

　　①大小大、中、小、针尖状。可先将整个平板上的菌落粗略观察一下，再决定大、中、小的标准，或由教师指出一个大小范围。

　　②颜色黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉红色等。

　　③干湿情况干燥、湿润、粘稠。

　　④形态圆形、不规则等。（e）高度扁平、隆起、凹下。

　　⑤透明程度透明、半透明、不透明。

　　⑥边缘整齐、不整齐。

　　五、实验报告

　　P13：结果1、思考题3、4

　　1、比较各种来源的样品，哪一种样品的平板菌落数与菌落类型最多？

　　2、人多的实验室与无菌室（或无人走动的实验室）相比，平板上的菌落数与菌落类型有什么区别？你能解释一下造成这种区别的原因吗？

　　3、通过本次实验，在防止培养物的污染与防止细菌的扩散方面，你学到些什么？有什么体会？

　　六、实验总结

　　实验二、细菌简单染色和普通光学显微油镜的使用和细菌形态观察

　　一、目的要求

　　1．学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。

　　2．熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能。

　　3．学习并掌握油镜的原理和使用方法。

　　二、油镜物镜的基本原理

　　微生物学研究用的显微镜的物镜通常有低倍物镜（16mm，10×）、高倍物镜（4mm，40～45×）和油镜（1.8mm，95～100×）三种。油镜通常标有黑圈或红圈，也有的以“OI（oilimmer-sion）字样表示，它是三者中放大倍数最大的。根据使用不同放大倍数的目镜，可使被检物体放大1000～2000多倍。油镜的焦距和工作距离（标本在焦点上看得最清晰时，物镜与样品之间的距离）最短，光圈则开得最大，因此，在使用油镜观察时，镜头离标本十分近，需特别小心。使用时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n=1.52，与玻璃相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的`介质为空气，则称为干燥系，当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样就减低了视野的照明度。

　　利用油镜不但能增加照明度，更主要的是能增加数值孔径，因为显微镜的放大效能是由其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度（称为镜口角）的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积，可用下列公式表示：

　　NA＝n·sinα式中NA=数值孔径；n=介质折射率；α=最大入射角的半数，即镜口角的半数。因此，光线投射到物镜的角度愈大，显微镜的效能就愈大，该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。

　　所谓单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着色。例如，美蓝（亚甲蓝）实际上是氯化亚甲蓝盐（methylenebluechloride，缩写为MBC），它可被电离成正、负离子：MBC→methyleneblue++chloride-带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫（crystalviolet）、碱性复红（basicfu-chsin）、番红（又称沙黄，safranine）等。细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。

　　三、器材显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，香柏油，二甲苯，擦镜纸，生理盐水；结晶紫染色液，碱性复红染色液；金黄色葡萄球菌，大肠杆菌。

　　四、操作步骤

　　1、涂片

　　取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用无菌操作（参照实验一），分别挑取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌于二载玻片的水滴中（每一种菌制一片），调匀并涂成薄膜。注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀。

　　2、干燥于室温中自然干燥。

　　3、固定涂片面向上，于火焰上通过2—3次，使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。但不能在火焰上烤，否则细菌形态将毁坏。

　　4、染色放标本于水平位置，分别滴加染色液于涂片薄膜上，染色时间长短随不同染色液而定。结晶紫染色液染2—3分钟，石炭酸复红染色液约染1—2分钟。

　　5、水洗

　　染色时间到后，用自来水冲洗，直至冲下之水无色时为止。注意冲洗水流不宜过急，过大，水由玻片上端流下，避免直接冲在涂片处。冲洗后，将标本晾干或用吹风机吹干，待完全干燥后才可置油镜下观察。

　　6、镜检

　　（1）、低倍镜观察

　　（2）、高倍镜观察

　　（3）、油镜观察

　　①用粗调节器将镜筒提起约2cm，将油镜转至正下方。

　　②在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。

　　③从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中，其镜头几乎与标本相接，应特别注意不能压在标本上，更不可用力过猛，否则不仅压碎玻片，也会损坏镜头。④从接目镜内观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野出现物像为止，然后用细调节器校正焦距。如油镜已离开油面而仍未见物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物像看清为止。

　　用同样的方法观察枯草芽孢杆菌染色标本。

　　⑤观察完毕，上旋镜筒。先用擦镜纸拭去镜头上的油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留油迹，最后再用干净擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头。用绸布擦净显微镜的金属部件。

　　⑥将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将接物镜转成八字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。

　　五、实验报告

　　1．结果：绘出你所观察到的经单染色的两种细菌形态图。（注明物镜放大倍数和总放大率）

　　2．思考题

　　P18思考题1、P28思考题2、3

　　（1）根据实验体会，你认为制备染色标本时，应注意哪些事项？

　　（2）制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？

　　（3）在明视野显微镜下，观察细菌形态时，你认为用染色标本好，还是用未染色的活标本好，为什么？

　　使用油镜按下列步骤操作：

　　1、先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，并将高倍镜转出。